产品货号:
HR8043
中文名称:
植物内质网蛋白提取试剂盒(非酶法)
英文名称:
Plant endoplasmic reticulum protein extraction kit non enzymatic method
产品规格:
50T|100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于从各种植物细胞和各种实体植物组织,如叶片、根、种子等植物组织中提取内质网蛋白。提取过程简单方便,制备的内质网蛋白不仅纯度高,保持天然活性,而且绝少交叉污染。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解植物内质网组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA,与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分,不可直接用于2D电泳,如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳,请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳,用脱盐柱脱盐处理。
本试剂盒采用非酶法提取,提取过程简单方便,速度快,可在1小时内完成,而且绝少交叉污染,但是蛋白回收率相比酶法较低。酶法提取制备的蛋白,回收率稍有提高,蛋白纯度高,保持天然活性,但是耗时较长。如果需要更加快捷的提取试剂盒,可以选择非酶法的提取试剂盒,对提取速度没有要求的话,可以选择酶法提取试剂盒。请根据实际需要选择试剂盒。
- 含蛋白稳定剂,提取的蛋白稳定。
- 紫外检测蛋白浓度时,背景干扰低。
- 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64,每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
组分 | 50T | 100T |
组份A:植物内质网蛋白提取液A | 100mL | 200mL |
组份B:植物内质网蛋白提取液B | 25mL | 50mL |
组份C:植物内质网蛋白提取液C | 15mL | 30mL |
组份D:蛋白酶抑制剂混合物 | 100μL | 200μL |
保存:蛋白提取液2~8℃,蛋白酶抑制剂-20℃,提取液A长期请置-20℃保存,有效期1年。
- 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2~8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
- 蛋白酶抑制剂在2~8℃时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
离心机、振荡器、涡旋混匀器、匀浆机/Dounce匀浆器、1×PBS(pH7.4)、100μm细胞筛
- 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
- 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
- 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
- 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
- 提取液制备:
每300μL提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
注:
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完,再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 - 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200~500mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎,加入1mL提取液A后用匀浆机充分匀浆或者用Dounce匀浆器充分匀浆。
注:
● 匀浆尽可能充分。至无明显可见固体。
● 培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可,匀浆后加提取液A混匀后直接进行以下步骤离心。
● 处理叶片等组织样本如果没有匀浆机,也可先加少量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆后再加提取液A混匀。 - 将匀浆用100μm细胞筛过滤。
注:
● 液体量少时可以加入1~2mL PBS混匀后再用细胞筛过滤。
● 没有细胞筛时可以不过滤,将匀浆液在4℃静置1分钟,待大的粗纤维,成团组织块等没有破碎的组织块自然沉降,吸取上清。或者以低于100×g力条件下离心1分钟,收集细胞上清,弃组织沉淀。
● 部分黏液较多的植物样本可能难以吸取,可以将1mL吸头的口剪掉一点再吸。 - 将滤液在200×g条件下离心3分钟,弃沉淀,收集上清。
- 在500×g条件下离心5分钟,弃沉淀,收集上清。
- 在1000g条件下离心10分钟,弃沉淀,收集上清。
- 将上清20000g力离心10分钟。弃沉淀,取上清。
- 将上清30000~50000×g离心45分钟。弃上清,留沉淀。
注:如果条件允许,可将离心力加大到100000×g,有利于回收光面内质网小泡。 - 在沉淀中加入400μL冷的试剂B,充分混匀。
- 在4℃,30000~50000×g力条件下离心45分钟。
注:如果条件允许,可将离心力加大到100000×g,有利于回收光面内质网小泡。 - 在沉淀中加入200~300μL提取液C,充分混匀。
- 置振荡器2~8℃振荡30分钟。
注:
● 用振荡器/摇床的较低转速,保持液体有轻微晃动即可。
● 没有低温振荡条件可以不振荡,在2~8℃静置,稍微延长处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 - 在4℃,14000×g条件下离心15分钟。
- 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即得到核蛋白。
- 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
注:
● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品:HR0329。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
- 蛋白浓度低?
植物核蛋白丰度比较低,在条件允许的情况下,尽可能增加样本量。
处理部分样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂A的匀浆次数,并适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理,没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 - 用什么方法定量蛋白?
建议用BCA法。不适合用Bradford法,因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份,导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系,则可以用Bradford法定量。 - 提取的蛋白具有活性吗?
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份,不破坏蛋白的结构,没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏,蛋白均保持其天然构象和活性。
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